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養殖香魚感染產氣單胞菌之病例及治療

劉文御

摘要
　　養殖香魚（Plecoglossus altivelis）發生了大量死亡的情形，罹病魚臨床急性症狀有：胸鰭基部及上、下顎出現出血性潰瘍，鰓部紅腫，而且表面增生許多黏液，並伴隨著嚴重的腹瀉，累積的死亡率可達100％。使用穿透式電子顯微鏡檢查沒有發現病毒，卻在腎臟的組織中發現許多細菌。利用商業化的細菌鑑定系統API 20E檢驗，確定優勢菌種是產氣單胞菌中的Aeromonas sobria。將病理組織的標本切片後，使用光學顯微鏡鏡檢，發現輸尿管及鮑氏囊中的腎小體上皮細胞的核出現腫大及崩解的現象。
　　對香魚血有溶血作用的Aeromonas sobria的菌株經過藥物最小抑制濃度（MIC μg/ml）的測試，以硝基𤤳喃（Nitrofurantoin）及紅黴素（Erythromycin）治療效果較佳，然而前者目前已禁用，後者使用濃度建議為128μg/ml。使用任何藥物前必須詢問合格獸醫人員，以免產生抗藥性菌株。

一、前言
　　在過去十餘年間，養殖香魚在臺灣及日本曾遭受細菌及病毒侵害，其中病毒有桿狀病毒（rhabdovirus; Kimura et al., 1986）及一種尚未命名的病毒：virus-BrAy-9201（Myung-Joo et al., 1995）；細菌性病原菌則有四類：Aeromonas salmonicida（Wang et al., 1996）、Pseudomonas sp.（Wakabayashi et al., 1996; Nakatsugawa and Iida, 1996）、Streptococcus sp.（Ohnishi and Jo, 1981; Ugajin, 1981）及Vibrio anguillarum（Song et al., 1986; Kawai and Kusuda, 1995）。養殖香魚如果遭受Pseudomonas感染將會出現出血性的腹水、鰓絲及腹腔內臟器無血色，脾臟、腎臟腫大等現象；如果遭受到Streptococcus感染，眼睛部位會出現系統性的敗血症，同時也會在體表或小腸表面出現出血性潰瘍。香魚如果被Vibrio anguillarum感染，肝臟及小腸會充血腫脹；另方面，被Aeromonas salmonicida感染後，在魚鰭基部則會出現出血點，同時出現眼球腫脹出血、鰓絲蒼白、小腸後半部充血、肝腫大、腎臟溶解、鰾腫大、脾臟灰白等症狀。
　　1998年5～6月間臺北縣金山鄉飼養之香魚幼魚發生急性大量死亡的現象，檢視罹病魚的上下顎有點狀出血、胸鰭基部及鰓絲有充血現象，並伴隨著急性腸炎及水瀉綠色糞便的病徵。
　　本研究嘗試尋找引起此病之病源是病毒或者細菌，並利用利用商業化鑑定系統API 20E鑑定細菌種類，並探討這些病原性細菌之溶血特性及是否有抗藥性出現，並找出正確藥物之治療方法。

二、材料及方法
(一)病材收集
　　在發生大量死亡期間取瀕死之香魚幼魚（平均體重17.5～56.43克）20尾，置入手提冰箱內帶回實驗室進行採集檢體的工作。
(二)穿透式電子顯微鏡（TEM）檢查
　　取罹病魚的腎臟組織固定在10％中性甲醛中，之後將組織置於0.2M的磷酸緩衝液中（pH＝7.3）30分鐘，後將組織置入1％四氧化鋨固定完全後，後經過脫水的過程將組織包埋在樹脂中，以備超微切片之用；將切片好之組織用2％之醋酸鈾醯染色之，後將處理好的組織送入TEM內進行判讀（陳等，1991）。使用之超微切片及電子顯微鏡型號為Hitachi H-600。
(三)組織學研究
　　罹病魚之鰓及內臟（包括心臟、肝、腎、小腸等）取出後立即放入10％的中性甲醛中固定，切片及染色採Humason（1979）所描述的方法。組織切片以一般光學顯微鏡觀察，並配合數位照相系統拍攝變異的現象，使用之數位照相設備為Kodak DCS 420及 MGDS（MicroGraphy Digitize Integrate System, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA）軟體分析系統。
(四)細菌鑑定及溶血能力測試
　　在無菌環境下以無菌環刺入上述罹病魚之腎臟，取出後塗抹於9公分大的TSA瓊脂培養基上（Difco），經24小時培養後，從每片培養基上逢機挑選兩個菌落，總數60個菌落經數次純化後，以商業化細菌鑑定系統 API 20E鑑定細菌的種類。
　　將上述純化後的菌株，以無菌操作方式，將無菌針分別刺入含綿羊血及香魚血之瓊脂培養基中，測試其溶血能力，如果刺入點的四周出現透明環，則表示有溶血能力。香魚血培養基製備係採Collins et al.（1989）所使用的方法。
(五)抗生素最小抑制濃度（MICμg/ml）試驗
　　使用紅黴素治療本病無法有效的控制香魚大量死亡的情況，因此必須進行本試驗。選擇鑑定出種類為A. sobria，而且具有溶血能力之菌株6株進行抗生素最小抑制濃度測試，使用瑞典AB Biodisk公司生產的6種不同之抗生素測試條︰ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, nitrofurantoin, streptomycin and tetracycline進行測試（稱E test）。細菌濃度以麥克法蘭（McFarland）濁度標準之0.5級數為標準，調好濃度之菌液以無菌棉花棒塗抹在15公分直徑之TSA瓊脂培養基上，培養溫度為35℃，培養時間18小時，而最小抑制濃度值則直接從測試條上讀取。

結果與討論
　　以穿透式電子顯微鏡觀察罹病魚中腎組織時，並未發現有病毒顆粒，反而有大量的細菌出現。此外，在光學顯微鏡檢查鰓、心臟、脾臟、肝臟等組織時，並未發現有異狀，然而在中腎及小腸後段有組織學上的變異，如在輸尿管及鮑氏囊中的腎小體上皮細胞的核出現腫大及崩解的現象。
　　此外，小腸後段的黏膜細胞壞死，並且在腸黏膜固有層出現了細胞浸潤及腫大的現象，在壞死的腸黏膜上也出現了大量的細菌。
　　細菌種類鑑定的結果如表一所示，有四株在鑑定過程中死亡，另有四株無法鑑定種類。在所鑑定的60株菌株中，Aeromonas屬佔有效菌株的78.84％（41/52），而且A. sobria為優勢種，而且在這些菌株當中，有溶血能力者佔了73.17％（30/41）（表一）。

表一：細菌種類鑑定及溶血能力之檢測

細菌種類	出現數量	溶血能力(H/Ha)
A. sobria	33	28(＋)/26(＋)
A. salmonicida	5	2(＋)/2(＋)
A. hydrophila	3	2(＋)/2(＋)
V. hollisae	1	1(＋)/1(＋)
V. vulnificus	1	1(＋)/－
V. spp.	1	－
Ps. putrefaciens	1	－
Ps. spp.	1	－
Bor./Alc. spp.	1	－
Mor. spp.	1	－
Pas. multocida	1	－
Pas. spp.	1	－
Ple. shigelloides	1	－
Ser. liquefaciens	1	－
無法鑑定菌株數	4
死亡菌株	4
鑑定菌株總數	60

備註︰A: Aeromonas; Alc: Alcaligenes Bor: Bordetella; Mor: Moraxella;

Pas: Pasteurella ; Ple: Plesiomonas; Ps: Pseudomonas; Ser: Serratia;

V: Vibrio。H: 接種綿羊血培養基之反應；

接種香魚血培養基後之反應；(＋)：正反應；–︰無反應。

　　選擇六株具有溶解香魚血能力之A. sobria，測試其抗生素抑制最小濃度結果發現，即使用同一種抗生素，不同的菌株其最小抑制濃度也會有不同（表二），以紅黴素（Em）為例，其最小的MIC值為0.38μg/ml，可是也會出現最大數值的128μg/ml，換句話說，檢測出最小的MIC值並不足以消滅所有的病原性細菌，而是要採試驗值的最大數值。

表二：選擇具有溶解香魚血能力之Aeromonas sobria測試其對六種抗生素最小抑制濃度之結果

Strain number	52804	52821	52826	6501	6510	6513
Am	-	96	-	-	-	-
Cl	64	64	16	-	-	-
Em	128	128	4	0.38	1.5	-
Ni	48	9	48	24	8	48
Sm	96	-	16	6	-	-
Tc	24	24	20	-	6	-

備註：

–︰無反應；Am：安比西林(Ampicillin)；Cl：綠黴素(Chloramphenicol)；EM：紅黴素(Erythromycin)；

Ni：硝基呋喃(Nitrofurantoin)；Sm：鏈黴素(Streptomycin)；Tc：四環素(Tetracycline)

　　六種藥物中以硝基𤤳喃（Ni）對所有菌株有效，且其最小抑制濃度不會超過48μg/ml，但是本藥劑有藥物殘留問題，目前已遭禁用，其他種類，如四環素、綠黴素、鏈黴素等也在禁止使用之列。
　　本病出現的症狀與感染A. salmonicida所產生的臨床症狀相當類似，但經過細菌鑑定後證明A. sobria為優勢種。
　　Zhao（1992）曾經報導感染香魚的V. anguillarum其R plasmid會傳遞抗藥性基因，因此在使用紅黴素過久，或者是因為投藥方法不正確，所以才會產生抗藥性菌株。經過本試驗得知，治療本病合法藥物為紅黴素，至於如何使用此藥必須請教獸醫人員。

參考資料
　　陳家全、李家維、楊瑞森，1991。生物電子顯微鏡學，國家科學委員會精密儀器發展中心編印，266頁。
　　Collins C.H., M.L. Patricia and J.M. Grange (1989): Collins and Lyne Microbiology Methods (6^th edition). Butterworth & Co (Publishers) Ltd, Halley Court, Jordan Hill, Oxford OX2 8EJ, pp. 63-64.
　　Humason G.L., (1979): Animal tissue techniques. Freeman WH and Co., San Francisco, CA, pp. 5-230.
　　Kawai K. and R. Kusuda (1995). A review: Listonella anguillarum infection in ayu, Plecoglossus altivelis, and its prevention by vaccination. Isr. J .Aquacult., 47(3-4): 173-177.
　　Kimura T., M. Yoshimizu and S. Gorie (1986). A new rhabdovirus isolated in Japan from cultured hirame (Japanese flounder) Paralichthys olivaceus and ayu Plecoglossus altivelis. Dis. Aquat. Org., 1: 209-217.
　　Myung-Joo Oh, M. Yoshimizu, T. Kimura and E. Yoshio (1995). A new virus isolated from salmonid fish. Fish Pathol., 30(1): 23-32.
　　Nakatsugawa T. and Y. Iida (1996). Pseudomonas sp. isolated from diseased ayu, Plecoglossus altivelis. Fish Pathol., 31(4): 221-227.
　　Ohnishi K. and Y. Jo (1981). Studies on Streptococcal infection in pond-cultured fishes-I, characteristics of a beta-hemolytic Streptococcus isolated from cultured ayu and amago in 1977-1978. Fish Pathol., 16(2): 63-67.
　　Song Y.L., S.N. Chen and G.H. Kou (1986). Serotyping of Vibrio anguillarum strains isolated from fish in Taiwan. Fish Pathol., 23(3): 185-189.
　　Ugajin M. (1981). Studies on Streptococcus sp. as a causative agent of an epizootic among the cultured ayu (Plecoglossus altivelis) in Tochigi prefecture, Japan, 1980, 1981. Fish Pathol., 16(3): 119-127.
　　Wakabayashi H., K. Sawada, K. Ninomiya and E. Nishimori (1996). Bacterial hemorrhagic ascites of ayu caused by Pseudomonas sp. Fish Pathol., 31(4): 239-240.
　　Wang W.S., D.H. Wang and J.S. Lee (1996). An outbreak of Aeromonas salmonicida infection of ayu (Plecoglossus altivelis) in Taiwan. Asian Fisheries Science, 9:235-238.
　　Zhao J., E-H. Kim, T. Kobayashi and T. Aoki (1992). Drug resistance of Vibrio anguillarum isolated from ayu between 1989 and 1991. Nippon suisan gakkaishi, 58(8): 1523-1527.

◆本文刊登於養魚世界雜誌2004年12月號

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